ด้วยเหตุผลดังกล่าว กลุ่มวิจัยเทคโนโลยีการหมักจากจุลินทรีย์ (Microbial Fermentation Technology) คณะทรัพยากรชีวภาพและเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี จึงร่วมกับภาคเอกชนคือบริษัท เค.เอ็ม.พี. ไบโอเทค จำกัด โดยได้รับทุนสนับสนุนการวิจัย จากสำนักงานคณะกรรมการการอุดมศึกษา ร่วมกันเสนอโครงการนำร่องเพื่อนำเอนไซม์โปรติเอส ไปใช้เป็นอาหารเสริมในสัตว์ปีก ประเภทไก่ โดยปัจจุบัน บริษัท เค.เอ็ม.พี ไบโอเทค เป็นบริษัทที่จำหน่ายผลิตภัณฑ์อาหารเสริมชีวภาพในสัตว์หลายประเภท เช่น สุกร ไก่ เป็ด และ กุ้ง ปัจจุบันสินค้าส่วนใหญ่ร้อยละ 90 เป็นผลิตภัณฑ์ที่ผลิตและพัฒนาขึ้นเอง มีประมาณร้อยละ 10 ของผลิตภัณฑ์เท่านั้นที่เป็นการนำเข้าจากต่างประเทศ และจัดเป็นบริษัทที่มียอดจำหน่ายอาหารเสริมที่มีคุณภาพสูง โดยผลิตภัณฑ์ส่วนใหญ่ได้รับการขึ้นทะเบียนรับรองจากกรมปศุสัตว์

วิธีการผลิตเอนไซม์โปรติเอส

เอนไซม์โปรติเอส เป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยาการไฮโดรไลซ์โปรตีน และโพลีเปปไทด์ให้เป็นกรดอะมิโนและเปปไทด์สายสั้น อุตสาหกรรมเทคโนโลยีการหมัก สามารถใช้จุลินทรีย์เป็นต้นแบบหรือแหล่งผลิตโปรติเอสได้ โดยเฉพาะโปรติเอสที่มีคุณสมบัติเป็น Serine alkaline protease ซึ่งสามารถผลิตจาก แบคทีเรีย ยีสต์และรา โดยเอนไซม์กลุ่มนี้มีคุณสมบัติทำงานได้ดี ในช่วงความเป็นกรด-ด่างที่กว้างคือ 4-11 และเป็นโปรติเอสกลุ่มที่นำมาเป็นอาหารเสริมในอุตสาหกรรมอาหารสัตว์

จากการศึกษาที่ผ่านมาในคณะผู้วิจัย พบว่า ราเส้นใย Aspergillus oryzae สามารถผลิตเอนไซม์โปรติเอสได้สูงมาก ระหว่างการหมักในอาหารเหลว (Submerged fermentation) กลุ่มวิจัยร่วมกับบริษัท เค.เอ็ม.พี ไบโอเทค จำกัด จึงสนใจในการนำราชนิดนี้ ซึ่งจัดเป็นจุลินทรีย์ในกลุ่มที่ถือว่ามีความปลอดภัย (GRAS, Generally Regarded As Safe) เป็นแหล่งผลิตเอนไซม์โปรติเอสเพื่อเป็นอาหารเสริมแก่สัตว์ปีกและจำหน่ายระดับอุตสาหกรรม เพื่อทดแทนการนำเข้าในประเทศต่อไป

อนึ่งทราบกันดีว่า การควบคุมการเจริญของราเส้นใยในอาหารเหลว เป็นสิ่งที่ไม่ง่ายนัก เนื่องจากราเส้นใย มักจะก่อให้เกิดความหนืดในอาหารเหลวในถังหมัก และควบคุมการหมักได้ยากทั้งยังเป็นอุปสรรคต่อการถ่ายเทออกซิเจน และอาหารในน้ำหมัก แต่ปัญหาดังกล่าวจะน้อยลง ถ้าสามารถควบคุมให้ราเส้นใยเจริญเป็นก้อนกลม (เพลเล็ท) แทนการเจริญเป็นเส้นใย จากงานวิจัยระดับห้องปฏิบัติการ คณะผู้วิจัยได้ศึกษาปัจจัยควบคุมให้ราเส้นใยนี้เจริญเป็นเพลเล็ทระหว่างการหมักในอาหารเหลว และได้ศึกษาถึงการผลิตระดับขยายขนาดที่หน่วยปฏิบัติการ สถาบันพัฒนาและฝึกอบรมโรงงานต้นแบบ (สรบ.) พบว่า สามารถควบคุมให้ราเจริญเป็นเพลเล็ทและผลิตโปรติเอสได้ ซึ่งถือเป็นความสำเร็จระดับหนึ่งของงานวิจัยการเลี้ยงราเส้นใยในอาหารเหลวขั้นสูง

ขอกล่าวสรุปปัจจัยหลัก  ในการควบคุมรูปร่างราเส้นใย ในอาหารเหลวในถังหมัก ดังต่อไปนี้

1. ปัจจัยทางกายภาพ : เป็นปัจจัยที่เกี่ยวข้องโดยตรงระหว่างการหมักในอาหารเหลวของราเส้นใย เช่น ความเป็นกรด-ด่างของน้ำหมัก  : ในช่วงความเป็นกรด-ด่างที่แตกต่างกัน จะส่งต่อรูปร่างราที่ปรากฎแตกต่างกัน แม้ในราเส้นใยชนิดเดียวกัน ยังไม่มีข้อมูลระบุโดยตรงว่าช่วงความเป็นกรด-ด่าง ใด มีผลต่อรูปร่างราอย่างไร

ความเร็วรอบการกวนของใบพัดในถังหมัก : แน่นอนว่ารอบการกวนที่สูงขึ้น มีผลทำให้ได้เพลเล็ทขนาดเล็กลง และราเส้นใยมีโอกาสก่อตัวเป็นเส้นใยยาว ๆ ได้ยากมาก แต่ขณะเดียวกัน การกวนรอบการกวนที่สูงมีผลต่อการเกิดแรงเฉือนในราเส้นใยมาก และมีผลต่อผลิตภัณฑ์ที่ต้องการ

สภาพบรรยากาศของน้ำหมักระหว่างการหมัก : เป็นปัจจัยที่อาจเสริมให้เกิดรูปร่างที่เป็นเส้นใยได้ดี หรือส่งเสริมการเกิดเป็นเพลเล็ทได้เช่นกัน ซึ่งเป็นเรื่องที่ผู้วิจัยควรเข้าใจจุลชีววิทยาของราที่ศึกษา จึงจะสามารถนำปัจจัยนี้มาร่วมส่งเสริมสภาพที่ต้องการได้

รูปร่างและใบกวนของถังหมัก : ถังหมักโดยทั่วไปที่ใช้อยู่ในห้องปฏิบัติการทั่วไป เป็นแบบที่มีใบพัดเหมาะกับการเลี้ยงแบคทีเรีย ที่ทนต่อแรงเฉือนได้สูง ซึ่งต่างจากราเส้นใย  ที่ไม่ทนแรงเฉือน ในการวิจัยเบื้องต้นส่วนใหญ่หลีกเลี่ยงได้ยาก กับการต้องใช้ถังหมักลักษณะดังกล่าว หรือแม้แต่ถังหมักระดับโรงงานต้นแบบหรือการผลิตระดับอุตสาหกรรม ซึ่งแน่นอนว่า ส่วนใหญ่จะออกแบบให้ใช้ประโยชน์ได้กว้างขวาง กับจุลินทรีย์ทั่วไป ดังนั้น งานวิจัย ควรทำใจหรือวางแผนล่วงหน้าว่า  ถังหมักที่จะใช้ต่อในระดับขยายขนาด ส่วนใหญ่จะเป็นถังหมักแบบหรือชนิดเดียวกับที่ใช้เลี้ยงแบคทีเรียทั่วไป นั่นคือ ควรศึกษาปัจจัยเหล่านี้เพื่อให้มีผลกระทบต่อผลิตภัณฑ์หรือรูปร่างราน้อยที่สุด

2. ปัจจัยทางเคมี : ส่วนใหญ่เป็นปัจจัยเกี่ยวข้องกับสารอาหารที่ใช้ในการเจริญของราเส้นใย เช่น มีรายงานการลดแหล่งไนโตรเจนที่เป็น แอมโมเนียมไนเตรท ว่ามีผลทำให้ได้ขนาดของเพลเล็ทใหญ่ขึ้น หรือปัจจัยของฟอสเฟตที่อยู่ในน้ำหมัก ส่งเสริมการเกิดเพลเล็ทได้เช่นกัน หรือการใช้ความเข้มข้นแหล่งคาร์บอน เช่นกลูโคสที่แตกต่างกัน ก็เป็นปัจจัยควบคุมรูปร่างเพลเล็ทได้เช่นกัน แต่อย่างไรก็ดี ปัจจัยเหล่านี้ บางครั้งไม่สามารถนำมาใช้อ้างอิงได้ในราที่แตกต่างกัน จำเป็นต้องอาศัยการวิจัยค้นคว้าเพิ่มเติม

อนึ่งปัจจัยที่กล่าวข้างต้นนี้ ถ้ามองดูเผิน ๆ เหมือนกับว่าเป็นปัจจัยที่เป็นอิสระ หรือเป็นปัจจัยโดด ๆ ที่สามารถควบคุมการเจริญของราเส้นใยรูปแบบต่าง ๆ ได้ ดังกล่าวข้างต้น แต่ในทางปฏิบัติ (ร่วมกับทางทฤษฎีแล้ว) หาได้เป็นเช่นนั่นไม่ ปัจจัยเหล่านี้ อาจเป็นปัจจัยที่เสริมหรือหักล้างอีกปัจจัยได้ ตัวอย่างเช่น ความเป็นกรด-ด่างของน้ำหมักระหว่างการหมัก แม้จะเป็นผลร่วมกันระหว่างสารต่าง ๆ ทั้งที่เป็นสารอาหารหรือเมทาบอไลท์ที่ปรากฎในน้ำหมักระหว่างการหมักซึ่งขึ้นกับวิถีการเจริญของราขณะนั้น และสามารถควบคุมให้ได้ค่าความเป็นกรด-ด่างที่ต้องการได้ แต่ขณะเดียวกันก็จำเป็นต้องคำนึงถึงช่วง pH ที่ให้ผลดีต่อการผลิตผลิตภัณฑ์ และอยู่ในช่วงที่สามารถควบคุมรูปร่างราได้เช่นกัน นั่นคือ กระบวนการการหมัก ไม่สามารถละเลยการศึกษาค่าที่ให้ผลดีที่สุดหรือเหมาะสมที่สุดต่อสิ่งที่ผู้วิจัยต้องการศึกษา หรือตัวอย่างอื่น ๆ เช่นการปรับสภาพบรรยากาศให้มีออกซิเจนน้อยระหว่างการหมัก เพื่อทำให้เกิดเป็นเพลเล็ทหรือสภาพเซลล์เดี่ยวคล้ายยีสต์ (yeast like form) ในราบางชนิด สามารถทำได้โดยตรงจากก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ ขณะเดียวกันผู้วิจัยก็สามารถเลือกหรือใช้ปัจจัยอื่น ๆ ได้ เพื่อควบคุมได้เช่นกัน เช่นการใช้ความเข้มข้นสูงของกลูโคส สามารถบังคับให้จุลินทรีย์เกิดวิถีการเจริญแบบไร้อากาศได้  และทำให้ได้เพลเล็ท หรือสภาพเซลล์เดี่ยวคล้ายยีสต์ได้เป็นต้น

ที่กล่าวข้างต้น เป็นปัจจัยกว้าง ๆ เพื่อให้เกิดความเข้าใจในการเลี้ยงราเส้นใยในอาหารเหลวในถังหมัก ในงานวิจัยการผลิตโปรติเอสจากราเส้นใย Aspergillus oryzae ได้นำปัจจัยดังกล่าวมาศึกษา และสามารถสรุปปัจจัยสำคัญในการควบคุมรูปร่างราเส้นใยชนิดนี้คือ

1. หัวเชื้อเริ่มต้น : ในงานวิจัยสรุปได้ว่า การใช้หัวเชื้อเริ่มต้นเป็นสปอร์ ระหว่างการหมักจะได้ลักษณะปรากฏ 2 แบบ คืออาจเป็นเส้นใยหรือเพลเล็ทก็ได้ ขึ้นกับสภาพแวดล้อม เช่น ความเร็วรอบการกวนที่แตกต่างกันจะให้ลักษณะปรากฏต่างกัน (ตั้งแต่ 250-700 รอบต่อนาที) ขณะที่การใช้หัวเชื้อเริ่มต้นเป็นเพลเล็ท ได้ลักษณะปรากฎที่เป็นเพลเล็ทในทุกความเร็วรอบการกวนที่ศึกษา (ตั้งแต่ 250-700 รอบต่อนาที)

2. ความเร็วรอบการกวน : ในกรณีที่ใช้หัวเชื้อเป็นสปอร์ การใช้รอบการกวนที่สูงขึ้น ตั้งแต่ 250-550 รอบต่อนาที จะได้ขนาดเพลเล็ทที่เล็กลงเรื่อย ๆ ตามจำนวนรอบการกวนที่เพิ่มขึ้น และเมื่อเพิ่มความเร็วรอบจนถึง 700 รอบต่อนาที จะได้ราที่เป็นเส้นใยเส้นสั้นเพียงอย่างเดียวในระหว่างการหมัก ในขณะที่การใช้หัวเชื้อเริ่มต้นเป็นเพลเล็ท จะได้ราที่เป็นเพลเล็ทในทุกความเร็วรอบที่ศึกษาดังกล่าวข้างต้น โดยความเร็วรอบการกวนสูงจะได้ขนาดเพลเล็ทที่เล็ก  ขนาดเพลเล็ทที่เล็ก รวมทั้งลักษณะราเส้นใยเส้นสั้น จะผลิตโปรติเอสที่ต้องการได้สูง

การทดสอบภาคสนามการนำโปรติเอสไปใช้กับไก่

ได้มีการนำผลิตภัณฑ์โปรติเอสที่ได้ไปทดสอบกับไก่ ทั้งไก่ไข่และไก่เนื้อหลายฟาร์ม โดยทางบริษัทเค.เอ็ม.พี. ไบโอเทคจำกัด เป็นผู้ดำเนินการ   ขอยกตัวอย่างเพียง 2 ฟาร์ม ดังนี้

การทดสอบในไก่ไข่ จังหวัดขอนแก่น : ช่วงดำเนินการ วันที่ 7 มกราคม 2548 ถึง 18 กุมภาพันธ์ 2548 (เปรียบเทียบเฉพาะช่วง 6 สัปดาห์แรกของไก่ไข่)

สัตว์ทดลอง : ไก่ไข่พันธุ์ Isa Brown เพศผู้ จำนวน 10,000 x 6 ตัว แบ่งเป็น 2 ชุด คือ ชุดเล้าควบคุมที่มีการให้อาหารปกติของฟาร์ม (C1, C2, C3)  และชุดเล้าทดลองคือ เล้าที่มีการใช้เอนไซม์โปรติเอสเป็นสารเสริม (T1, T2,T3) ดำเนินการเป็น 3 ซ้ำในแต่ละชุด

ผลการทดลอง : ตารางข้างล่างสรุปผลเปรียบเทียบของเล้าควบคุมและเล้าทดลอง

การทดสอบในไก่เนื้อ จังหวัดสระบุรี : ช่วงดำเนินการ วันที่ 24 ธันวาคม 2548 ถึง 30 มกราคม 2549
สัตว์ทดลอง : ไก่เนื้อพันธุ์ Arbor Acres เพศผู้ จำนวน 9,900 x 3 ตัว แบ่งเป็น 2 ชุด คือ ชุดเล้าควบคุมที่มีการให้อาหารปกติของฟาร์ม (C)  และชุดเล้าทดลองคือ เล้าที่มีการใช้เอนไซม์โปรติเอสเป็นสารเสริม (T1, T2)

ผลการทดลอง : ตารางข้างล่างสรุปผลเปรียบเทียบของเล้าควบคุมและเล้าทดลอง

จากผลการทดลองที่ได้ยืนยันว่า การใช้เอนไซม์โปรติเอสในไก่เนื้อ  (T1 & T2) ได้น้ำหนักเฉลี่ย (kg) , น้ำหนักเฉลี่ยไก่เพิ่มขึ้นต่อวัน (ADG) และค่า Production index สูงกว่าเล้าควบคุม (C) อนึ่ง อัตราการตายของไก่เนื้อทั้ง 2 ชุด มีค่าสูงเนื่องจากช่วงการเลี้ยงไก่อยู่ช่วงที่มีอากาศหนาวเย็น (ปลายเดือนธันวาคมถึงต้นเดือนมกราคม) ทำให้ไก่ตาย

สรุปผลการทดสอบการใช้โปรติเอสในไก่

จากผลการทดสอบใช้เอนไซม์โปรติเอสเป็นอาหารเสริมในสัตว์ปีกโดยเฉพาะไก่ไข่และไก่เนื้อ สรุปได้ว่าการใช้เอนไซม์โปรติเอสเป็นอาหารเสริมในสัตว์ปีกประเภทไก่ ให้ผลดีกว่าชุดควบคุมที่ไม่มีการใช้เอนไซม์โปรติเอส ซึ่งทำให้เห็นว่า แนวทางการใช้โปรติเอสเป็นอาหารเสริมในสัตว์ปีกในเมืองไทยมีความเป็นไปได้สูง และที่สำคัญเป็นเอนไซม์ซึ่งดำเนินการผลิตได้เองภายในประเทศ จากเทคโนโลยีการเลี้ยงราเส้นใยในอาหารเหลว

เอกสารอ้างอิง

Cohen,B.L., 1973, Regulation of intracellular and extracellular neutral and alkaline protease in Aspergillus nidulan, Journal of General Microbiology, 29, 311-320.

Cohen,B.L., Morris,J.E. and Drucker,H., 1975, Regulation of two extracellular protease of Neurospora crassa by induction and by carbon-nitrogen and sulfur-metabolite repression, Archives of Biochemistry and Biophysics, 169, 324-330.

Cohen,B.L., 1981, “Regulation of protease production in Aspergillus”, Transactions of the British Mycological Society, 76, 447-450.

Cui,Y.Q., van der Lans, R.G.J.M., Giuseppin,M.L.F. and Luyben,K.C.A.M., 1998, “Influence of fermentation conditions and scale on the submerged fermentation of Aspergillus awamori”, Enzyme and Microbial Technology,23, 157-167.

Lindberg,R.A., Rhodes,W.G., Eirich,D.L. and Drucker,H., 1982, Extracellular acid proteases from Neurospora crassa, Journal of Bacteriology, 150, 1103-1108.

McIntyre,M. and McNeil,B., 1997a, “Effect of carbon dioxide on morphology and product synthesis in chemostat cultures of Aspergillus niger A60”, Enzyme and Microbial Technology,21,479-483.

McIntyre, M. and McNeil, B., 1997b, “Effects of elevated dissolved CO2 levels on batch and continuous cultures of Aspergillus niger A60 : an evaluation of experimental methods”, Applied and Environmental Microbiology, 63, 4171-4177.

Nielsen,J., Johansen,C.L., Jacoben,M., Krabben,P., Villadsen,J., 1995, "Pellet formation and fragmentation in submerged cultures of Penicillium chrysogenum and its relation to penicillin production", Biotechnology Progress, 11, 93-98.

Rao,M.B., Tanksale,A.M., Ghatge,M.S. and Deshpande,V.V., 1998, Molecular and biotechnological aspects of microbial protease, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62,597-635.

Ross, I.K., De Bernardis, F., Emerson, G.W., Casson, A. and Sullivan, P.A., 1990, The secreted aspartate proteinase of Candida albican : physiology of secretion and virulence of proteinase deficient mutant, Journal of General Microbiology, 136, 687-694.

White, S. McIntyre, M., Berry, D.R. and McNeil, B., 2002, The autolysis of industrial filamentous fungi, Critical Reviews in Biotechnology, 22(1), 1-14.